Rekombináns fehérjék bioszintézisének fejlesztése prokarióta expressziós rendszerben

Abstract

A génklónozástól a fehérjetisztításig a rekombináns fehérjék bioszintézisének minden lépésében alkalmazandó molekuláris eszközök számos alternatívában és széles körben hozzáférhetőek. Ezen bőség ellenére nem ritka a funkcionális rekombináns fehérje bioszintézisének kudarca a gazdaszervezetre gyakorolt fehérjetoxicitás vagy a zárványtestekben történő aggregáció miatt. A rekombináns fehérjék előállítására ma már széles körben alkalmaznak különféle mikrobiális rendszereket. Annak ellenére, hogy az Escherichia coli (E. coli) a leggyakrabban használt gazdaszervezet a rekombináns fehérjék bioszintézisére, prokarióta rendszerként számos korláttal rendelkezik, amelyek közül az idegen fehérjék oldhatatlan zárványtestekké történő aggregációja képezi a legfőbb limitáló tényezőt. Ezzel szemben az E. coli alacsony fenntartási költségeinek, egyszerű genetikai állományának előnyei elengedhetetlenek olyan új rendszerek megtervezéséhez, amelyek a gazdasejtben a rekombináns fehérje túltermelésére irányulnak. A gén- és fehérjetechnológiai eljárások lehetővé teszik új, személyre szabott stratégiák tervezését a felhasználói vagy folyamati követelményeknek megfelelően. A fúziós technológiák széles körben alkalmazottak E. coli expressziós rendszerben az oldható rekombináns fehérjetermelés és/vagy tisztítás javítására. Az ubikvitin fúziós partner alkalmazása lehetővé teszi kis molekulatömegű peptidek előállítása során a proteázokkal szembeni védelem és stabilitás mellett a célfehérje specifikus hasítását, affinitás címke-mentes natív fehérje bioszintézisét. Jelen PhD értekezés az E. coli expressziós rendszerben történő rekombináns fehérjetermelés fejlesztésére irányuló stratégiákat tárgyalja három példán keresztül a fehérjetermelés hatékonyságnövelésének aktuális lehetőségeiből: 1. ubikvitin fúzió sikeres alkalmazása a natív SMAC és a gazdatörzsre nézve toxikus BUFII fehérjék bioszintézisére (fúziós stratégia); 2. zárványtestben termelődő GST-XIAP (aggregátumok) szolubilizálása, majd refoldingja a fehérje aktív formájának előállítására (poszttranszlációs renaturálás stratégia); 3. autoindukció alkalmazása az AURKA oldhatatlan zárványtestekké történő aggregációja ellen(fermentációs körülmények beállításán alapuló stratégia). Az autóindukciós fermentáció körülményeinek beállítása céljából az EGFP-t, átfogóan tanulmányozott rekombináns fehérjét választottunk, amely hagyományos, IPTG alapú indukció során is hatékony oldott formájú, aktív fehérjetermelést eredményez.